一種免疫學(xué)技術(shù)，將產(chǎn)生抗體的單個B淋巴細(xì)胞同骨髓腫瘤細(xì)胞雜交， 獲得既能產(chǎn)生抗體， 又能無限增殖的雜種細(xì)胞，并以此生產(chǎn)抗體。是僅由一種類型的細(xì)胞制造出來的抗體，對應(yīng)于多克隆抗體、多株抗體——由多種類型的細(xì)胞制造出來的一種抗體。
技術(shù)介紹
單克隆抗體技術(shù)(monoclonal antibody technique) 1975年英國科學(xué)家Milstein和Kohler所發(fā)明，并獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。 1984 德國人G. J. F.Kohler、阿根廷人C. Milstein[3]和丹麥科學(xué)家N. K. Jerne由于發(fā)展了單克隆抗體技術(shù)，完善了極微量蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)而分享了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。 其原理是: B淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗體， 但在體外不能進(jìn)行無限分裂; 而瘤細(xì)胞雖然可以在體外進(jìn)行無限傳代， 但不能產(chǎn)生抗體。將這兩種細(xì)胞融合后得到的雜交瘤細(xì)胞具有兩種親本細(xì)胞的特性。免疫反應(yīng)是人類對疾病具有抵抗力的重要因素。當(dāng)動物體受抗原刺激后可產(chǎn)生抗體。抗體的特異性取決于抗原分子的決定簇，各種抗原分子具有很多抗原決定簇，因此，免疫動物所產(chǎn)生的抗體實(shí)為多種抗體的混合物。用這種傳統(tǒng)方法制備抗體效率低、產(chǎn)量有限，且動物抗體注入人體可產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。此外，要把這些不同的抗體分開也極困難。近年，單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)，是免疫學(xué)領(lǐng)域的重大突破。
操作過程
動物免疫
(1) 抗原制備。制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機(jī)會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應(yīng) 根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質(zhì)不穩(wěn)定，提純時易變性，或其免疫原性很強(qiáng)，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化 或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強(qiáng)時，則必須對抗原進(jìn)行純化。檢測用抗原可以是與 免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。
(2) 免疫動物的選擇。根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因?yàn)�，所有的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來 源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進(jìn)行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一 般分泌抗體的能力不穩(wěn)定，因?yàn)槿旧w容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。
(3) 免疫程序的確定。免疫是單抗制備過程中的重要環(huán)節(jié)之一，其目的在于使B淋巴細(xì)胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交 瘤的機(jī)會。因此在設(shè)計免疫程序時，應(yīng)考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時間、佐劑的應(yīng)用及動物對該抗原的應(yīng)答能力等。沒有一個免 疫程序能適用于各種抗原�，F(xiàn)用的免疫程序中多數(shù)是參照制備常規(guī)多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內(nèi)免疫法包括皮下注 射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點(diǎn)眼。最后一次加強(qiáng)免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者，因?yàn)榭墒箍乖瓕ζ⒓?xì)胞作用更迅速而充分。 在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾融合為好，許多實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果表明，初次免疫和再次免疫應(yīng)答反應(yīng)中，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應(yīng)答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應(yīng)答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗 體。筆者體會陽性雜交瘤出現(xiàn)的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無明顯的平行關(guān)系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達(dá)到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿 母細(xì)胞，這在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾進(jìn)行融合較適宜。已有人報道采用脾內(nèi)免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應(yīng)性，且節(jié)省時間，一般免疫3天后即可融合。
細(xì)胞融合
首先制備細(xì)胞培養(yǎng)基、 氨基喋呤（A）貯存液、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液等各種細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)。然后制備髓瘤細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞，之后進(jìn)行細(xì)胞融合。在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時單個或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，這 種被加入的活細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)其他細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明了，一般認(rèn)為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長 條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性。
細(xì)胞篩選
雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測。抗體檢測的方法很多，通常根據(jù)所研究的抗原和 實(shí)驗(yàn)室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測方法必須具有快速、準(zhǔn)備、簡便，便于一次處理大量樣品等特點(diǎn)。因?yàn)橥袔装賯�樣品需要在短短幾個小時就報 告結(jié)果，以便決定雜交瘤細(xì)胞的取舍。所以選用抗體檢測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費(fèi)小和節(jié)省人力。一般說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測 方法，并克服可能存在的問題。另一個重要問題是抗
體檢測方法所需要的“動力學(xué)范圍”，即檢出背景以上的最強(qiáng)與最弱信號之比，依所用的檢測抗原是否純凈而 定。如雜交瘤抗體是針對純化的蛋白質(zhì)抗原的，100%的抗原參與反應(yīng)，一個陽性/陰性判別系統(tǒng)就夠了。另一方面，如果雜交瘤抗體是針對細(xì)胞表面微量的蛋白 抗原，檢測系統(tǒng)可能需要能測出微弱信號，則動力學(xué)范圍至少應(yīng)為10：1，最好為100：1。另外，檢測方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預(yù)定的用途的 影響。結(jié)合補(bǔ)體的抗體可以用基于細(xì)胞毒性反應(yīng)的檢測方法來選出。如需結(jié)合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結(jié)合蛋白A的檢測方法。
克隆化
從原始孔中得到的陽性雜交瘤細(xì)胞，可能來源于二個或多個雜交瘤細(xì)胞，因此它們所分泌的抗體是不同質(zhì)的。為了得到完全同質(zhì)的單克隆抗體，必須對雜交瘤細(xì)胞進(jìn) 行克隆化。另一方面，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細(xì)胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體的能力。為了除去這部分已不再分泌抗體的細(xì)胞，得到分泌 抗體穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞系（又稱亞克�。残枰寺』�。另外，長期液氮凍存的雜交瘤細(xì)胞，復(fù)蘇后其分泌抗體的功能仍有可能丟失，因此也應(yīng)作克隆化， 以檢測抗體分泌情況。通常在得到針對預(yù)定抗原的雜交瘤以后需連續(xù)進(jìn)行2-3次克隆化，有時還需進(jìn)行多次。所謂克隆化是指使單個細(xì)胞無性繁殖而獲得該細(xì)胞團(tuán) 體的整個培養(yǎng)過程�？寺』姆椒ê芏�，如有限稀釋法、軟瓊脂法、單細(xì)胞顯微操作法、單克隆細(xì)胞集團(tuán)顯微操作法和熒光激活細(xì)胞分類儀（FACS）分離法。
凍存與復(fù)蘇
（1）雜交瘤細(xì)胞的凍存。在建立雜交瘤細(xì)胞的過程中，有時一次融合產(chǎn)生很多“陽性”孔，來不及對所有的雜交瘤細(xì)胞作進(jìn)一步的工作，需要把其中一部分細(xì)胞凍存起來；另一方面，為了防 止實(shí)驗(yàn)室可能發(fā)生的意外事故，如停電、污染、培養(yǎng)箱的溫度或CO2控制器失靈等給正在建立中的雜交瘤帶來災(zāi)難，通常盡可能早地凍存一部分細(xì)胞作為種子，以 免遭到不測。在雜交瘤細(xì)胞建立以后，更需要凍存一大批，以備今后隨時取用。
（2）雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇。雜交瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞在液氮中保存，若無意外情況時，可保存數(shù)年至數(shù)十年。復(fù)蘇時融解細(xì)胞速度要快，使之迅速通過最易受損的-5℃—0℃，以防細(xì)胞內(nèi)形成冰晶引起細(xì)胞死亡。
鑒定單抗特性
⑴ 單克隆性的確定 包括雜交瘤細(xì)胞的染色體分析、單抗免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型的鑒定和單抗純度鑒定等。
⑵ 單抗理化特性的鑒定。從實(shí)用意義上說，單抗對溫度和PH變化的敏感性以及單抗的親合力都是理化特性鑒定的主要項(xiàng)目，它們可為單抗的使用和保存提供重要依據(jù)。
⑶ 單抗與相應(yīng)抗原的反應(yīng)性測定。單抗與相應(yīng)抗原的反應(yīng)性決定于它所識別的抗原表位，確定單抗針對的表位在抗原結(jié)構(gòu)上的位置，是單抗特性鑒定的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時，進(jìn)一步分析這類表位的差別， 可正確評價單抗的特異性和交叉反應(yīng)性。
類型
鼠源性抗體
雜交瘤單克隆抗體制備技術(shù)的基本原理是利用聚乙二醇作為細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)胞與具有不斷繁殖能力的小鼠骨髓瘤細(xì)胞在體外進(jìn)行融合，在HAT選擇性培養(yǎng)基的作用下，只讓融合成功的雜交瘤細(xì)胞生長，經(jīng)過反復(fù)的免疫學(xué)檢測篩選和單個細(xì)胞培養(yǎng)(克隆化)，最終獲得既能產(chǎn)生所需單克隆抗體，又能不斷繁殖的雜交瘤細(xì)胞系，將這種細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，在其產(chǎn)生的腹水中即可得到高效價的單克隆抗體。由于單抗的應(yīng)用是從體外診斷向體內(nèi)腫瘤定位和治療方向發(fā)展，故鼠源性單抗出現(xiàn)了難以克服的缺點(diǎn)，特別是在體內(nèi)應(yīng)用時，存在主要組織相容性抗原(MHC)和超敏反應(yīng)問題。隨著鼠源單克隆抗體在臨床治療中越來越廣泛的應(yīng)用，降低抗體免疫原性的要求也變得越來越迫切。為了克服這一問題科學(xué)家利用基因工程方法使小鼠的抗體人源化。通過構(gòu)建人一鼠嵌合抗體，在一定程度上減弱了人抗鼠抗體。
人鼠嵌合抗體
為了克服鼠源性單克隆抗體存在的問題，科學(xué)家利用基因工程方法使小鼠的抗體人源化。通過構(gòu)建人一鼠嵌合抗體，在一定程度上減弱了人抗鼠抗體。1984年Morrison等人成功地構(gòu)建了第一個人鼠單克隆抗體即嵌合抗體。嵌合抗體指的是鼠單克隆抗體的恒定區(qū)基因被人抗體的恒定區(qū)基因通過基因重組技術(shù)所替換而編碼并在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)而產(chǎn)生的單克隆抗體。
基本原理:抗體分子的特異性識別、抗原結(jié)合由輕鏈和重鏈可變區(qū)決定的，而異源蛋白產(chǎn)生的人抗鼠抗體反應(yīng)的主要是抗體恒定區(qū)。將小鼠單抗恒定區(qū)用人源化恒定區(qū)代替而拼接成嵌合抗體，使其重鏈和輕鏈的可變區(qū)來自小鼠，恒定區(qū)來自人類。簡言之嵌合抗體既具有抗原結(jié)合特異性，又大大地降低了鼠單抗的異源性。嵌合抗體是基因工程抗體最早研究出來的一種抗體，在腫瘤治療和診斷方法已被廣泛的應(yīng)用。雖然嵌合抗體在一定程度上減弱了人抗鼠抗體反應(yīng)，但仍存在一少部分鼠源成分。這直接導(dǎo)致抗體被迅速清除，從而降低治療效果。
人源化抗體
1.改形抗體
1986年，Jones等人成功構(gòu)建了第一個改形抗體，又稱CDR移植抗體和人源化抗體，指將鼠單抗可變區(qū)中互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列取代人源抗體相應(yīng)CDR序列，重組構(gòu)成既具有鼠源性單抗特異性，又保持人抗體親和力的CDR移植抗體。迄今為止，已有100多種鼠單抗通過CDR移植得到了人源化�；驹�:抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)主要由CDR和骨架區(qū)(FR)組成。其中可變區(qū)的6個CDR是負(fù)責(zé)識別和結(jié)合抗原的區(qū)域，它們直接與抗原接觸，決定了抗體的特異性。骨架區(qū)是可變區(qū)以外的其它部分，主要起著支持CDR的作用，而且它們的氨基酸組成和排列相對不易改變，因此，可以將鼠單抗的CDR移植到人單抗的骨架區(qū)，就有可能使人單抗獲得鼠單抗一樣的抗原特異性，并可以最大限度地降低鼠單抗的異源性，這樣就得到了改形抗體。與嵌合抗體相比，改形抗體進(jìn)一步減少了抗體中鼠源部分的比例，降低了人抗鼠抗體，但仍有抗體可能導(dǎo)致抗獨(dú)特型抗體的產(chǎn)生且存在一些局限性，例如構(gòu)建方法相對復(fù)雜，操作起來費(fèi)時費(fèi)力;抗體的晶體結(jié)構(gòu)以及電腦模擬抗體的微細(xì)結(jié)構(gòu)上都有很大的問題;降低免疫原性和保持抗原結(jié)合活性方面還有很多問題。理所當(dāng)然，尋找既能實(shí)現(xiàn)人源化又可以保持高的免疫學(xué)活性的簡單易行方法勢在必行。
2.表面氨基酸殘基人源化一一鑲面抗體
1991年由Padlan提出的與CDR移植完全不同的降低鼠源抗體免疫原性的方法。[9]其理論依據(jù)是分析了大量鼠單抗可變區(qū)和人單抗可變區(qū)氨基酸殘基的表面暴露情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些暴露的氨基酸殘基位置和數(shù)量都非常保守，不因?yàn)榉N屬和型別而改變。研究表面，這些暴露的氨基酸殘基是鼠源可變區(qū)免疫原性的主要來源。將鼠單抗可變區(qū)表面暴露的骨架區(qū)氨基酸殘基中與人可變區(qū)相應(yīng)的氨基酸殘基改為人源的，就可以使可變區(qū)表面人源化，消除了異源性而不影響可變區(qū)的整體空問構(gòu)象。
3.表位印記選擇
表位印記選擇指的是一種與高效篩選噬菌體抗體庫技術(shù)相結(jié)合的人源化抗體的方法，可以通過數(shù)論篩選就能得到完全人源的抗體�；驹�:鼠單抗的一個重鏈或者輕鏈可變區(qū)基因與人源抗體的重鏈或者輕鏈的可變區(qū)基因文庫配對，得到雜合的人鼠抗體庫。借助噬菌體抗體庫的高效篩選方法，能迅速得到所需抗體，比CDR移植簡單且能得到真正的人抗體。缺點(diǎn):篩選工作量特別大。
小分子抗體
小分子抗體顧名思義是分子量較小的抗體片段，它的抗體分子的抗原結(jié)合部位僅僅局限于重鏈和輕鏈的可變區(qū)。雖然分子很小但它既保持了親本單抗的親和力具有親本單抗一樣的特異性。種類主要包括:抗原結(jié)合片(Fab)抗體、Fv抗體、單鏈抗體、單域抗體與最小識別單位。
1.Fab抗體
Fab抗體為僅含Fab分子，Fab段由完整的輕鏈(恒定區(qū)CL和可變區(qū)VLCL)和重鏈Fd段(第一恒定區(qū)CH1和可變區(qū)VH)通過一個二硫鍵連接形成異二聚體，整個分了大小約占總抗體的三分之一，僅含有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)。將完整輕鏈和重鏈Fd的編碼基因進(jìn)行連接，可在大腸桿菌中表達(dá)，形成完整的二硫鍵和立體折疊，可以保存Fab斷的功能。常被用于實(shí)驗(yàn)室的研究工具。
2.Fv抗體
Fv抗體僅由輕鏈和重鏈的可變區(qū)組成通過非共價鍵連接，是抗體分了保留完整抗原結(jié)合部位的最小功能片段。該片段由于是通過非共價鍵連接的，所以穩(wěn)定性不好，十分容易解離。采用適當(dāng)?shù)姆椒▉斫鉀QFv片段穩(wěn)定性問題。
3.單鏈抗體
單鏈抗體的問世解決了Fv抗體的穩(wěn)定性問題。它由適當(dāng)?shù)墓押似账嵝蛄袑⑤p鏈和重鏈可變區(qū)連接而成，形成單一鏈的分子，故稱為單鏈抗體。就是單一鏈的結(jié)構(gòu)大大增加了Fv片段的穩(wěn)定性。相對完全抗體而言，單鏈抗體在臨床上作為治療劑有好多優(yōu)越性。但它也有親和力下降等缺點(diǎn)。
4.單域抗體
單域抗體僅含重鏈可變區(qū)，結(jié)構(gòu)比Fv的亞單位還小，它是一個具有抗原結(jié)合活性的分子。同完整抗體相比，單域抗體仍然具有與抗體結(jié)合的同等能力及穩(wěn)定性。
5.最小識別單位
比單域抗體還小的最小識別單位僅含可變區(qū)中單一CDR結(jié)構(gòu)，分子量十分小僅占完全抗體的1%左右，親和力也相當(dāng)?shù)�，所以被命名為最小識別單位。雖然最小識別單位分子量小、親和力低，但是它具有與抗原結(jié)合的能力。
人源性抗體
從最初的鼠源單抗技術(shù)到人源化技術(shù)，單克隆抗體在幾十年的歲月中取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。人源化的問世使單克隆抗體基本解決了人抗鼠源性問題。但有用人源化的抗體基因均來自雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤的這個操作過程很復(fù)雜且耗時加之利用雜交瘤技術(shù)難以制備自身抗原抗體和全人源抗體，這兩大缺點(diǎn)成為基因工程抗體應(yīng)用的絆腳石。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步單克隆抗體進(jìn)入了一個嶄新的發(fā)展階段一一人源性單克隆抗體。它主要包括噬菌體抗體庫技術(shù)、轉(zhuǎn)基因小鼠制備人源性抗體、核糖體展示技術(shù)三部分。