蛋白表達系統(tǒng)概述
蛋白表達系統(tǒng)是指由宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系。通過這個體系可以實現(xiàn)外源基因在宿主中表達的目的。一般由以下幾個部分組成：
1、宿主。表達蛋白的生物體�？梢詾榧毦�、酵母、植物細胞、動物細胞等。由于各種生物的特性不同，適合表達蛋白的種類也不相同。
2、載體。載體的種類與宿主相匹配。根據(jù)宿主不同，分為原核（細菌）表達載體、酵母表達載體、植物表達載體、哺乳動物表達載體、昆蟲表達載體等。載體中含有外源基因片段。通過載體介導，外源基因可以在宿主中表達。
3、輔助成分。有的表達系統(tǒng)中還包括了協(xié)助載體進入宿主的輔助成分。比如昆蟲-桿狀病毒表達體系中的桿狀病毒。
蛋白表達科學研究
rBPI56或其功能性氨基端片段通常在真核細胞中表達，將有助于獲得具有生物學活性抗G菌重組蛋白。但因該種表達方式存在成本高、表達量低等問題而影響其實際應用。用原核細胞表達BPI23-Fcγ1重組蛋白。
Profinity eXact融合標簽表達系統(tǒng)：利用bio-rad rofinity eXact 系統(tǒng)制備無標簽、N 端無任何其它殘基 的重組蛋白只需大約1 小時。該親和介質(zhì)較為穩(wěn)定，可多次用于目的蛋白的純化，從而節(jié)約了 成本。適用于純化以不溶的聚集體形式存在的重組蛋白。Profinity eXact 融合標簽系統(tǒng)的有效性和一致性將使其成為獲得高產(chǎn)率無標簽重組蛋白的通用平臺。
蛋白表達系統(tǒng)分類及優(yōu)劣分析
原核蛋白表達系統(tǒng)既是最常用的表達系統(tǒng)，也是最經(jīng)濟實惠的蛋白表達系統(tǒng)。原核蛋白表達系統(tǒng)以大腸桿菌表達系統(tǒng)為代表，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高和表達產(chǎn)物分離純化相對簡單等優(yōu)點，缺點主要是蛋白質(zhì)翻譯后缺乏加工機制，如二硫鍵的形成、蛋白糖基化和正確折疊，得到具有生物活性的蛋白的幾率較小。
酵母蛋白表達系統(tǒng)以甲醇畢赤酵母為代表，具有表達量高，可誘導，糖基化機制接近高等真核生物，分泌蛋白易純化，易實現(xiàn)高密發(fā)酵等優(yōu)點。缺點為部分蛋白產(chǎn)物易降解，表達量不可控。
哺乳動物細胞和昆蟲細胞表達系統(tǒng)主要優(yōu)點是蛋白翻譯后加工機制最接近體內(nèi)的天然形式，最容易保留生物活性，缺點是表達量通常較低，穩(wěn)定細胞系建立技術(shù)難度大，生產(chǎn)成本高。
大腸桿菌表達系統(tǒng)
在各種表達系統(tǒng)中，最早被采用進行研究的是大腸桿菌表達系統(tǒng)，也是目前掌握最為成熟的表達系統(tǒng)，大腸桿菌表達系統(tǒng)以其細胞繁殖快速產(chǎn)量高、IPTG誘導表達相對簡便等優(yōu)點成為生產(chǎn)重組蛋白的最常用的系統(tǒng)。
對于表達不同的蛋白，需要采用不同的載體。目前已知的大腸桿菌的表達載體可分為非融合型表達載體和融合型表達載體兩種。非融合表達是將外源基因插到表達載體強啟動子和有效核糖體結(jié)合位點序列下游，以外源基因mRNA的AUG為起始翻譯，表達產(chǎn)物在序列上與天然的目的蛋白一致。融合表達是將目的蛋白或多肽與另一個蛋白質(zhì)或多肽片段的DNA序列融合并在菌體內(nèi)表達。融合型表達的載體包括分泌表達載體、帶純化標簽的表達載體、表面呈現(xiàn)表達載體、帶伴侶的表達載體。
大腸桿菌表達系統(tǒng)優(yōu)點在于遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達量高、表達產(chǎn)物容易純化、穩(wěn)定性好、抗污染能力強以及適用范圍廣等。
酵母表達系統(tǒng)
酵母表達系統(tǒng)作為一種后起的外源蛋白表達系統(tǒng)，由于兼具原核以及真核表達系統(tǒng)的優(yōu)點，正在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應用，應用此系統(tǒng)可高水平表達蛋白，且具有翻譯后修飾功能，故被認可為一種表達大規(guī)模蛋白的強有力的工具。
常用的酵母表達系統(tǒng)：
一，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表達系統(tǒng)：
釀酒酵母(Saecharomycescerevisiae)在釀酒業(yè)和面包業(yè)的使用已有數(shù)千年的歷史，被認為是GRAS(generally recognized as safe)生物，不產(chǎn)生毒素，已被美國FDA確認為安全性生物，但釀酒酵母難于高密度培養(yǎng)，分泌效率低，幾乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白質(zhì)，也不能使所表達的外源蛋白質(zhì)正確糖基化，而且表達蛋白質(zhì)的C端往往被截短。因此，一般不用釀酒酵母做重組蛋白質(zhì)表達的宿主菌
二，甲醇營養(yǎng)型酵母表達系統(tǒng)：
甲醇酵母表達系統(tǒng)是目前應用最廣泛的酵母表達系統(tǒng)。目前甲醇酵母主要有漢森酵母屬(Hansenula)，畢赤酵母屬(Pichia)，球擬酵母屬(Torulopsis)等，并以畢赤酵母屬(Pichia)應用最多。
甲醇酵母的表達載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中，大部分甲醇酵母的表達載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在該基因的啟動子(PAOX1)作用下，外源基因得以表達。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導表達外源蛋白。這樣可以大大提高表達產(chǎn)量。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達克級。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細胞，不會發(fā)生超糖基化。
酵母表達的特點酵母是一種單細胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長繁殖速度迅速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達基因工程產(chǎn)品時，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本。
昆蟲表達系統(tǒng)
昆蟲表達系統(tǒng)是一類應用廣泛的真核表達系統(tǒng)，它具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾加工以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力。昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的真核表達系統(tǒng)。利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強啟動子構(gòu)建的表達載體，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達。它具有真核表達系統(tǒng)的翻譯后加工功能，如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白；其最高表達量可達昆蟲細胞蛋白總量的50%；可表達非常大的外源性基因(一200kD)；具有在同一個感染昆蟲細胞內(nèi)同時表達多個外源基因的能力；對脊椎動物是安全的。由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在此蛋白的強大啟動子作用下獲得高效表達。常用的桿狀病毒包括苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)和家蠶型多角體病毒(BmNPV)，常用的宿主細胞則來源于草地夜蛾Sf9細胞，用于表達外源基因的質(zhì)粒來源于PUC系列，其含有一個多克隆位點和多角體蛋白啟動子。 [2]
桿狀病毒系統(tǒng)的主要優(yōu)點包括：
1，組蛋白具有完整的生物學功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配
2，蛋白翻譯后的加工修飾；
3，表達水平高，可達總蛋白量的50%；
4，可容納大分子的插入片段；
5，能同時表達多個基因。主要缺點是外源蛋白表達處于極晚期病毒啟動子的調(diào)控之下，這時由于病毒感染，細胞開始死亡。
哺乳動物表達系統(tǒng)
哺乳動物細胞表達外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染。利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞需幾周甚至幾個月時間，而利用病毒表達系統(tǒng)則可快速感染細胞，在幾天內(nèi)使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達產(chǎn)物中檢測出目的蛋白。哺乳動物細胞表達載體必須包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等控制元件。